Dicas de CultivoHistória da Orquidologia

Cultivo in vitro o que é?

Catasetum fimbriatum

Micropropagação in vitro

A multiplicação in vitro de orquídeas através da germinação de sementes, foi sem dúvidas o primeiro passo para muitas das técnicas existentes hoje aplicadas à biotecnologia. Um dos grandes nomes e desbravadores desta área foi David Moore que em 1849 publicou um trabalho intitulado “On growing orchids from seeds”.  A partir de então, pesquisadores, produtores e entusiastas tem utilizado técnicas de micropropagação in vitro em ambientes controlados para multiplicação de orquídeas.

Mas o que é a micropropagação in vitro?

Esta técnica consiste em basicamente utilizar um ambiente propício para o crescimento e desenvolvimento das plantas. Para isso utiliza-se o chamado meio de cultura. O meio de cultura nada mais é do que uma solução composta de macro e micronutrientes necessários que ficam à disposição da planta para que ela possa crescer e desenvolver. Estas concentrações dos nutrientes não podem ser muito altas doses para não causar intoxicação, mas também não podem ser muito baixas para não causar o déficit nutricional. Caso um meio de cultura seja preparado de forma inadequada, o resultado esperado pode ficar comprometido e pode facilmente ocasionar a perda de todas as plantas. Além da concentração dos nutrientes, o pH do meio de cultura é muito importante. Para que todos os nutrientes estejam disponíveis para a absorção, o pH deve estar em torno de 5,8. Valore muito discrepantes podem levar à indisponibilidade dos nutrientes. Além disso, condições de temperatura e luminosidade também devem ser cuidadosamente ajustas.

Hoje existe um grande número formulações de meios de culturas, que oferecem variadas concentrações de nutrientes e os mais diversos aditivos como vitaminas, hormônios vegetais e até mesmo extrato de frutas. Entretanto, todas apresentam algumas características em comum. Por exemplo, todos os meios de cultura oferecem fontes dos chamados macro e micronutrientes. Entretanto, eles podem conter quantidades de diferentes ou até mesmo a forma como este elemento mineral é fornecido pode mudar. Por exemplo o nitrogênio, algumas formulações o nitrogênio é fornecido na forma de nitrato, outras como amônio. Além disso, é possível que haja a suplementação de nitrogênio com fornecimento de ureia e até mesmo com aminoácido como a glutamina. Essas variações também podem ser aplicadas aos outros nutrientes minerais. Dessa forma, não existe a melhor formulação, tudo vai depender da planta, estágio de desenvolvimento (semente, plântulas, planta adulta, embriogênese) e do objetivo (germinação, clonagem, cultura de células e entre outras).

Em si tratando de formulação, certamente a mais conhecida e mais utilizada em laboratórios é a proposta por Toshio Murashige e Folk Skoog em 1962 (também conhecido como Meio MS). Murashige e Skoog formularam este meio para cultura de medula de Nicotiana tabcum (tabaco). Com o passar do tempo, grande parte dos trabalhos realizados com cultura de tecidos (mesmo com outras espécies de plantas) começaram a utilizar o meio MS. Composição conforme tabela abaixo.

Entretanto, meios direcionados à pesquisa com orquídeas já existiam antes da proposta de Murashige e Skoog. Dentre os mais utilizados podemos destacar Lewis Knudson, que em 1946 propôs uma formulação para germinação de orquídeas. Na época, ele trabalhou com a espécie Cattleya mossiae e com um híbrido de Cattleya Dinah x Cattleya Bembridge. Knudson fez testes com duas formulações a B e a C, chegando à conclusão que o meio de cultura C era o mais indicado para germinação de Cattleyas. A tabela abaixo traz a formulação.

Após a publicação de Knudson, outros pesquisadores também publicaram diferentes formulações como Emil F Vacin e Fritz W Went (1949). Ao analisar a formulação proposta por Knudson, Vacin e Went perceberem que com o passar do tempo, havia uma intensa variação do pH do meio de cultura. Tendo em vista que a disponibilidade dos nutrientes depende do pH do meio de cultura, esta variação poderia causar prejuízos para o crescimento e desenvolvimento da planta.  Vacin e Went mostraram que após 110 dias de cultivo, o pH do meio caiu de 5,46 para 3,76 e 87 dias depois (197 dias no total) o pH caiu para 3,16. Isso mostra que a formulação de Knudson não proporcionava uma estabilidade de pH. O próximo passo foi descobrir quais compostos eram responsáveis por causar tamanha variação. Vacin e Went descobriram que o Nitrato de Cálcio (Ca(NO3)2) e o Sulfato de Ferro II (FeS04) eram os responsáveis pela instabilidade. Assim eles propuseram a substituição do Nitrato de Cálcio por Fosfato de Cálcio (Ca3(P04)2), mantendo assim a fonte de cálcio. O Sulfato de Ferro II foi substituído por um sal orgânico Fe2(C4H4O6)3 o mais utilizado na época era o tartarato de ferro. Resolvendo assim os problemas da variação de pH. Além disso, para balancear as fontes de nitrogênio, foi adicionado o Nitrato de Potássio. A tabela abaixo traz a formulação proposta por Vacin e Went.

Veja que a formulação de um meio de cultura é algo mais complexo que apenas misturar fontes de nutrientes. Vários fatores devem ser levados em consideração. Curiosamente tanto Knudson quanto Vacin e Went prepararam meios de cultura com formulações relativamente parecidas. E ambos se preocuparam apenas com uma classe de nutrientes os macronutrientes. Em ambos os casos não há fornecimento de micronutrientes. Dessa forma, é usual suplementar estes dois meios de cultura com a solução de micronutrientes do meio MS (tabela abaixo), proporcionando uma composição nutritiva mais completa.

Além de nutrientes minerais é bastante comum a suplementação com nutricional com vitaminas e aminoácidos como por exemplo piridoxina, mio-inositol, glutamina e tiamina. Da mesma forma, extratos vegetais também são comunmente utilizados como a peptona de soja, água de coco e banana. Curiosamente, Vacin e Went em 1949 fizeram outro trabalho testando suco de tomate como frente nutricional para germinação de orquídeas. O mais impressionante é que de acordo com os autores, o suco de tomate aumentou as taxas de crescimento de Epidendrum Obrienianum. Um outro composto bastante utilizado em meio de cultura para orquídeas é o carvão ativado. Este composto foi utilizado pela primeira vez em 1970 pelo Professor Peter Werkmeister. Em seu experimento Werkmeister utilizou o carvão ativado para escurecer o meio para estudar o gravitropismo das raízes e propagação de clones. Em 1974 o professor Robert Enst publicou um trabalho onde plantas de Phalaenopsis e Paphiopedilum cresceram melhor em meios onde o carvão ativado estava presente. Daí em diante, grande parte dos meios de cultura apresentam carvão em sua formulação. Além disso, os cultivadores de orquídeas começaram a utilizar o carvão vegetal (não ativado) para promover o crescimento, uma prática utilizada até hoje. Mas existe um ponto a ser considerado, o carvão não é um suplemento nutricional. Ele funciona como um adsorvente (capturador) de moléculas que causam a oxidação do meio de cultura, inibindo o crescimento da planta. Dessa forma, se a planta não tem como característica a liberação de compostos oxidantes pelas raízes, não há a menor necessidade de utilizar o carvão ativado. Até porquê, sabe-se que o carvão de madeira não fornece um aporte nutricional relevante como demonstrado por Pastor-Villegas e colaboradores (2006). Curiosamente muita gente utiliza de forma indiscriminada o carvão como substrato para cultivo de plantas em vaso. O que pode representar um perigo para as plantas.

Esta é uma pequenas parte da história do cultivo in vitro.

Curiosidade

Sabia que um discípulo de Folk Skoog fez história no Brasil?  

Foi o Prof. Dr. Felix Kurt Rawitscher que veio para trabalhar no Brasil ajudando a fundar o Departamento de Botânica do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Dr. Felix Kurt Rawitscher teve alguns orientados dentre ele o Prof. Dr. Gilberto Barbante Kerbauy, fundador do Laboratório de Fisiologia Vegetal do IB-USP e precursor da cultura de tecidos no Brasil. O Prof. Dr. Gilberto Kerbauy dedicou seus mais de 40 anos de carreira para estudos com desenvolvimento de orquídeas. Hoje ele figura entre os grandes nomes da fisiologia de orquídeas no mundo. Clique aqui para saber a história completa

Referências

Knudson, L. (1946) A new nutriente solution for the germination of orchid seed. Amer. Orchid Soc. Bull. Vol. 15, pp. 214-217.

Murashige, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. Vol 15, pp. 473–497.

Pastor-Villegas, J., Pastor-Valle, J.F., Rodríguez, J.M.M., García, M.G., 2006. Study of commercial wood charcoals for the preparation of carbon adsorbents. J. Anal. Appl. Pyrolysis 76, 103–108.

Vacin, E.F., Went, F.W. (1949) Some pH Changes in Nutrient Solutions. Bot. Gaz. Vol. 110 (4), pp. 605-613.

Vacin, E.F., Went, F.W. (1949) Use of Tomato Juice in the Asymbiotic Germination of Orchid Seeds. Bot. Gaz. Vol. 111 (2), pp. 175-183.

Yam, T.W., Arditti, J. Micropropagation of Orchids. 3ed, Chichester, John Wiley & Sons, Inc., 2017.
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